三丁酸甘油酯平板透明圈法篩選脂肪酶高產(chǎn)菌株，根據(jù)菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及分子生物學特征鑒定高產(chǎn)菌株，再用酸堿滴定法定量測定脂肪酶活性，該菌株硝酸鹽還原為陽性，可以水解淀粉和液化明膠。 基于16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，SLB-1菌株與登記號NR116240的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌處于最小分支，因此SLB-1菌株與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌相同本研究分離鑒定脂肪酶產(chǎn)生菌Bacillus  methylotrophicus  SLB-1，該菌產(chǎn)生的脂肪酶為中性常溫酶.脂肪酶產(chǎn)生菌株的篩選、鑒定。 采集富含油的水樣，用羅丹明 B培養(yǎng)基進行初篩，形態(tài)觀察、生理生化試驗和16S  r  DNA序列分析相結(jié)合進行菌種鑒定，構(gòu)建了系譜樹。 結(jié)果篩選了一株產(chǎn)生脂肪酶的細菌U5，鑒定為枯草[0x4e  22 ]。

通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗設(shè)計對發(fā)酵培養(yǎng)基中的三丁酸甘油酯、葡萄糖、尿素添加量進行發(fā)酵優(yōu)化。 結(jié)果表明，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為： 三丁酸甘油酯2.0%(V/V  )、葡萄糖9 g/L、尿素8 g/L。 在該優(yōu)化條件下，粗脂肪酶酶活性為4.3 U/m  L，比優(yōu)化前的酶活性提高了16.22%。 綜合考慮密碼子嗜好性、RNA穩(wěn)定性及自由能等因素，優(yōu)化疏松棉狀嗜熱絲孢霉(tll  )耐熱脂肪酶(tll  )基因序列，合成全部基因。

將合成的tll基因連接到克隆載體上，將亞克隆連接到表達載體pHGWPT-tll上，通過根癌農(nóng)桿菌對被孢霉sh2進行了轉(zhuǎn)化。 經(jīng)過三丁酸甘油酯平板、SDS-PAGE及Western  Blotting鑒定，tll基因表達成功。 發(fā)酵72h，轉(zhuǎn)化子脂肪酶的活性最大為36U/mL。

轉(zhuǎn)化體通過等離子體變異得到的變異株脂肪酶的活性比出發(fā)株提高了約37%。 本研究將人工合成的RML基因RML克隆到畢赤酵母表達載體pPIC9K，構(gòu)建pPIC9K-rml誘導型表達載體。 表達載體被線性化轉(zhuǎn)化為巴斯德畢赤酵母GS115，用抗生素G418篩選，用三丁酸甘油酯mm板及PCR法篩選陽性重組工程菌。 工程菌發(fā)酵液經(jīng)SDS-PAGE分析、三丁酸甘油酯板鑒定，脂肪酶RML在畢赤酵母中有效表達，顯示蛋白分子大小如預期。 進一步優(yōu)化了包括培養(yǎng)基組分、誘導劑濃度、發(fā)酵溫度等優(yōu)化在內(nèi)的發(fā)酵條件。

優(yōu)化的培養(yǎng)基組為： 甘油 4.0%，(NH4)2SO45.000 g/L，CaSO40.465 g/L，K2SO49.100 g/L。 培養(yǎng)條件采用：pH值6.0，生育階段溫度30，誘導階段采用22低溫誘導，誘導期每24 h補充甲醇濃度3%。 優(yōu)化后，發(fā)酵液中RML的活力最高為116 U/ml，比優(yōu)化前提高3.14倍。

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